第125期雙柱層析（MCSGP）在治療性寡核苷酸純化的應用

2019年11月22日來源：管理員

本文講述了如何將單柱層析轉化為雙柱層析（MCSGP）用于純化治療性寡核苷酸，從而顯著提高產品的收率以及生產效率。

采用2根相同的層析柱，將第1根層析柱洗脫下的低純度組分回收到第2根層析柱繼續(xù)純化，可同時保證純度和收率。在本例中，單柱層析的收率僅為60%，而MCSGP在滿足目標純度要求前提下的收率則高達94%，顯著優(yōu)于單柱層析。MCSGP工藝開發(fā)，是通過Contichrom HPLC系統(tǒng)的MCSGP向導軟件來實現(xiàn)的。

介紹

化學合成的寡核苷酸已廣泛應用于DNA測序、聚合酶鏈反應（PCR）和分子克隆。寡核苷酸的未開發(fā)潛力在于其以靶向方式修飾基因表達的能力，從而為人類疾病帶來新的、有效的治療效果。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，寡核苷酸已成為繼小分子、多肽和蛋白質藥物之后的主要開發(fā)藥物之一，預計寡核苷酸藥物將很快應用于以往無法治療的遺傳疾病上。鑒于寡核苷酸的合成成本較高，收率的增加將會對生產的經(jīng)濟性產生重大好處。

治療性寡核苷酸的生產過程需要去除合成副產物，以使藥物純度符合要求，一般需采用層析方法進行精純，但這通常會使收率降低40-60%。作為對策，可以將純度較低的產品單獨收集，并選擇再次進行層析提純，但這會明顯降低生產效率，而且會增加分析檢測的工作量。因此，迫切需要有更先進的層析手段來提高收率，并替代現(xiàn)有的層析方法。

MCSGP（Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification）可同時保證高純度和高收率，有結果表明，與單柱層析相比，MCSGP可在滿足目標純度的前提下，使產品收率提高至90%。因此，MCSGP克服了單柱層析時收率和純度無法兼得的問題，并且由于收率的提高，通常還可保證更高的生產效率和更低的溶劑消耗量。

MCSGP原理

圖1. 傳統(tǒng)單柱層析（左）：重疊組分被舍棄或暫時保留以再次進行層析。

MCSGP（右）：將重疊組分進行循環(huán)回收，不斷去除雜質，收集純產品。

與單柱層析不同，MCSGP是使用2根相同的層析柱進行連續(xù)層析（圖1）。然而，兩者的分離原則是基本一致的，即在層析過程中，都將樣品分離得到3部分：純產物、雜質和產物的重疊組分、僅含雜質的部分。收集純產物部分，舍棄或重新處理含有雜質的重疊組分。如果將重疊組分舍棄，會使有價值的產物發(fā)生損失。對重疊組分進行再處理會積累雜質，因此適用性受到限制。此外，將重疊組分暫時保留并再次進行層析會降低整體生產效率。MCSGP通過內部回收（recycle）重疊組分，反復分離雜質和純產物，從而同時保證純度和收率。組分的回收過程是自動完成的，不需要進行離線分析。重疊組分從一個層析柱轉移到另一個層析柱，并在每個cycle中會有新的樣品再次上柱。這樣可以確保連續(xù)操作，并在不影響純度的情況下獲得高收率的產品。

材料和方法

在30%氨水中制備治療性寡核苷酸，最終濃度為45 g/L，并通過反相HPLC測得純度為73.8%（圖2）。

圖2. 上樣樣品反相層析分析圖譜

反相層析方法：采用單柱層析和雙柱MCSGP純化寡核苷酸，兩種模式均通過Contichrom HPLC 30層析系統(tǒng)進行操作，并記錄280 nm處紫外吸收值。使用2個內徑0.77 cm、柱床高度10 cm的Hiscreen Q Sepharose FF柱（柱體積為2×5 mL）。溶劑為25 mm NaOH（A相）和25 mm NaOH+2 M NaCl（B相）。對于單柱層析，每次上樣量為每mg填料上樣1 mL。產品洗脫采用在線性梯度從10%B到90%B進行24 CV（柱體積）。共進行3次單柱層析操作，1次作為性能基準（Benchmark），2次作為MCSGP設計的基礎。

圖3. ChromIQ軟件Batch向導界面

單柱（Batch）方法是使用Batch向導創(chuàng)建的，如圖3所示。表1為單柱層析參數(shù)。

表1. 單柱層析參數(shù)比較。方法名稱中的數(shù)字（150&300）對應洗脫流速。

Benchmark使用20cm床高進行。運行MCSGP時，使用10cm床高的層析柱2根，以保證在recycle步驟中2柱串聯(lián)時的總高度不超過20cm。因此，僅運行單個10 cm層析柱的步驟（洗脫、清洗、CIP、再生）可以在2倍至3倍的線性流速下進行，而不超過層析柱的壓力限制。這將會轉化為更高的生產效率。采用10cm層析柱進行單柱層析，洗脫流速為300cm/h（Batch Run 300），作為MCSGP設計的基礎。分段收集，并采用HPLC對各分段組分進行分析檢測，以生成準確的純度曲線，從而快速實施MCSGP。

單柱層析結果

圖4和圖6為單柱層析圖譜。使用反相HPLC測定各洗脫組分的純度，并用超微量分光光度計測定各洗脫組分的濃度（圖5和圖7）。

圖4. Benchmark：Contichrom系統(tǒng)單柱層析圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導率）

圖5. Benchmark：洗脫組分檢測結果

圖6. Batch Run 300（用于MCSGP設計）：Contichrom系統(tǒng)單柱層析圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導率）

圖7. Batch Run 300：洗脫組分檢測結果

這兩種單柱層析的詳細過程參數(shù)比較見表5。在要求目標純度>91%的情況下，與Benchmark的20cm床高相比，采用10cm床高可產生更高的生產效率，這是因為10cm床高可使用更高的線性流速。然而，Batch Run 300的收率會比Benchmark低5%，這是因為滿足純度要求的收集范圍較窄。

MCSGP設計

可以單柱層析結果為基礎，通過MCSGP向導生成雙柱MCSGP方法（見圖8）。Contichrom系統(tǒng)的ChromIQ軟件可提供MCSGP向導功能。MCSGP采用與單柱層析相同的層析柱、溶液體系和相同的層析方案。

圖8. MCSGP向導：以單柱層析圖譜為基礎，整個MCSGP設計過程可在15分鐘內完成。

在STEP1中，需要將單柱層析圖譜加載到MCSGP向導（圖9）。在STEP2中，需要將檢測得到的各洗脫組分純度和濃度結果與單柱層析圖譜進行疊加。

圖9. MCSGP向導界面

在STEP3中，通過拖動不同顏色區(qū)域的邊界，將層析圖譜劃分為純產物（Product）、重疊組分（Recycle）以及雜質（Waste）（圖9和圖10）。可由系統(tǒng)軟件模擬計算得到收集樣品的純度，并可根據(jù)區(qū)域劃分的變化自動進行更新。

圖10. MCSGP向導STEP3示意圖，其中包括Recycle區(qū)域（A-B為藍色，C-D為綠色）和Product區(qū)域（B-C為紅色）

圖9和圖10突出顯示了三個區(qū)域，分別為1個Product區(qū)域（紅色）和2個Recycle區(qū)域（藍色和綠色）。MCSGP過程具體如下：

A：產品洗脫出峰時開始進行回收（Recycle）；

B：產品純度達到90%時開始收集目標物（Product）；

C：產品純度低于90%時結束收集目標物，并再次開始回收（Recycle）；

D：產品洗脫完畢，結束回收。

在STEP4中，可設定層析柱規(guī)格及上樣體積。MCSGP所使用的2根層析柱的規(guī)格型號、裝填高度均與單柱層析時相同。MCSGP向導會根據(jù)紅色區(qū)域與藍色、綠色區(qū)域的面積比例，自動調整上樣量，確保工藝穩(wěn)定。

在STEP5中，輸入與單柱層析相同的層析工藝參數(shù)，MCSGP向導會自動計算出稀釋因子，從而保證回收組分被稀釋后可與層析柱再次結合。

在STEP6中，MCSGP向導可以模擬計算出相關工藝參數(shù)并進行顯示，包括產品純度、生產效率、上樣量、溶液消耗量以及收集樣品的濃度，并可設定cycle次數(shù)。此外，MCSGP向導還可自動生成 start-up和shut-down方法。整個MCSGP設計過程可在15分鐘內完成。

分別以150 cm/h、300 cm/h和450 cm/h的洗脫流速進行了3次MCSGP運行，以保證在層析柱耐壓范圍內進行工藝測試，見表2。

表2. MCSGP方法參數(shù)比較。方法名稱中的數(shù)字（150、300和450）對應洗脫流速。

MCSGP操作

圖11為MCSGP Run 150層析圖譜，此為MCSGP的典型圖譜。層析圖譜顯示了2根層析柱可交替進行洗脫操作。2根層析柱在每個cycle中各會完成一次洗脫。

ChromIQ軟件還可以將連續(xù)過程（如MCSGP）的多個cycle進行疊加（圖12）。疊加圖譜表明從cycle2開始進入穩(wěn)態(tài)。

圖11. MCSGP Run 150層析圖譜，共顯示5個cycle

圖12. MCSGP純化寡核苷酸的疊加圖譜，共5個cycle。該圖顯示出洗脫曲線的變化很小，洗脫峰也很相似。第1組洗脫產物來自柱2（藍色曲線），第2組洗脫產物來自柱1（紅色曲線）。

每個cycle會進行2次收集，每柱各1次。檢測表明，每個cycle的產量、濃度、純度均一致。圖13為MCSGP的5個cycle分析圖譜疊加。HPLC檢測結果顯示，三種不同洗脫流速的MCSGP產品純度均高于91%的目標閾值，每次均運行5個cycle，見表4。

圖13.寡核苷酸反相分析圖譜，5個cycle的疊加顯示出一致的產品質量。此圖為MCSGP Run 150的結果，三種不同洗脫流速的MCSGP檢測結果相似。

表3為MCSGP Run 300的5個cycle工藝參數(shù)與MCSGP向導模擬計算結果的對比。實測數(shù)據(jù)與模擬計算結果接近，說明可以在單柱層析結果的基礎上，將MCSGP向導作為數(shù)據(jù)預測工具使用。

表3. MCSGP Run 300工藝參數(shù)與MCSGP向導模擬計算結果的對比

單柱層析與MCSGP工藝對比

從收率、純度、生產效率、產品濃度和溶液消耗等方面對單柱層析和雙柱MCSGP進行了計算和比較，MCSGP在各方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢（表5）。

將采用20cm床高的Benchmark與采用10cm床高的單柱模式（Batch Run 150和Batch Run 300）進行了對比，與預測情況相同，較短層析柱的收率會明顯低于較長的層析柱，這是因為較短的層析柱分辨率較低。然而，如果不考慮收率，就生產效率而言，較短的層析柱優(yōu)勢更明顯，尤其是在使用較高流速時。與采用20cm床高的Benchmark相比，采用10cm床高的單柱模式（共2根層析柱，累計床高20 cm）收率會從60%降至55%，但生產效率會提高3倍。

MCSGP的主要優(yōu)點是在目標純度大于91%的前提下，與所有單柱模式相比，產品收率可顯著提升。按照測試流速，在92%純度要求前提下，MCSGP收率可比Benchmark單柱模式高出50-57%，詳見表5、圖12和圖14。MCSGP收率也顯著優(yōu)于10cm床高的單柱模式。

在生產效率方面，MCSGP的優(yōu)點是在洗脫時可運行比Benchmark更高的流速，這是因為柱床高度降低了一半，層析柱反壓更低。這意味著，與Benchmark相比，MCSGP可使生產效率翻倍，而保證收率仍高于90%（圖15）。將MCSGP直接與10cm床高的單柱模式進行比較，發(fā)現(xiàn)10cm床高的單柱模式生產效率更高。首先，與MCSGP相同，10cm床高的單柱模式支持采用更高的流速。其次，與MCSGP不同，10cm床高的單柱模式?jīng)]有2柱串聯(lián)的步驟，因此避免了采用較低流速的過程。最后，由于MCSGP的recycle功能，每cycle的新樣品上樣量都會受限，本例中，每cycle的新樣品上樣量約為單柱模式的50%。實際上，對于許多大規(guī)模的寡核苷酸生產來講，收率增加5%比生產效率提高3倍更具有經(jīng)濟意義，這是因為寡核苷酸的合成成本很高（見表 5 Benchmark與Batch Run 300對比）。事實上，由于MCSGP在提高收率方面優(yōu)勢明顯，預計提高收率部分所產生的價值將迅速抵消購買連續(xù)流設備的成本投入（見文獻Müller-Sp?th, T., & Bavand, M. (2019). Purification of Synthetic Peptides by Countercurrent ?Chromatography (MCSGP)-Economic Evaluation. Pharmaceutical Engineering,? 39(2), 68–77）。因此，應該把提高純化收率作為本研究的主要目的。